Mutando con genes sintéticos, una buena manera de obtener proteínas mejoradas

Dr. Edson Cárcamo Noriega, Dra. Claudia Martínez Anaya y Dr. Paul Gaytán Colín

edsoncar@ibt.unam.mx

Mediante la aplicación del método científico, estudiantes e investigadores contestan preguntas que van desde lo más básico, hasta la resolución de problemas específicos en diversas áreas del conocimiento. Los resultados del gran número de experimentos que se llevan a cabo cotidianamente en el IBt son publicados en revistas internacionales para compartir esos hallazgos con otros investigadores en todo el mundo. En el IBt se publican anualmente alrededor de 150 artículos en revistas científicas. En esta sección se presenta una selección de resúmenes de publicaciones recientes del IBt, con la intención de dar una idea del panorama del trabajo experimental que hacen los investigadores y los estudiantes de nuestro instituto.

Las células de todos los organismos del planeta, grandes y microscópicos, están formadas, entre muchas otras moléculas, de proteínas.

Además de permitirnos la vida, las proteínas participan en nuestras actividades cotidianas más de lo que creemos, no sólo llevando a cabo procesos biológicos en nuestro cuerpo, o como nutrientes en los alimentos que consumimos, sino que se han aprovechado numerosas proteínas de diferente origen en procesos tecnológicos, por lo que están presentes en una gran variedad de productos de uso común como pinturas, pegamentos, detergentes, telas, papel, medicamentos, etc.

¿Pero, qué son las proteínas? Las proteínas son biomoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos cuyo orden es muy preciso y está establecido por la información codificada en el ADN de las células. La secuencia de las proteínas se compone de 20 aminoácidos diferentes, por lo que cada posición en la cadena podría estar precedida o seguida de algún otro de éstos 20, lo que resulta en un número inmenso de combinaciones posibles.

Por ejemplo, para una proteína pequeña formada por una cadena de 100 aminoácidos, existen más combinaciones en secuencia que granos de arena en el mundo. Imaginemos entonces la variabilidad que es posible en proteínas más grandes, teniendo en cuenta que el promedio anda en poco más de 300 aminoácidos, pudiendo llegar hasta los miles. A pesar de esta casi infinita posibilidad de combinaciones, en la naturaleza existe sólo una cantidad relativamente pequeña de proteínas que evolucionaron durante millones de años y se han mantenido hasta nuestros días (por selección natural) para realizar funciones específicas. Esto quiere decir que existen muchísimas posibilidades de combinaciones que nunca han ocurrido en la naturaleza, pero que podrían existir si nosotros las generamos en el laboratorio, cambiando alguno o varios de los aminoácidos, en una cierta posición de la secuencia para generar una variante que pudiera tener una función ligeramente diferente a la original. Esto representa un gran potencial en aplicaciones de utilidad para el hombre. En otras palabras, si la naturaleza creó una proteína que nosotros hemos estado usando (por ejemplo, en los detergentes para disolver mejor la grasa al lavar la ropa), pero que no resiste altas temperaturas (porque se desnaturaliza y deja de ser funcional), en el laboratorio nosotros podríamos tomar el gen de esa proteína y cambiar algunos pocos aminoácidos y crear una variante que haga lo mismo, pero que ahora resista al calor. A este tipo de manipulaciones se les llama ingeniería de proteínas.

El objetivo de la ingeniería de proteínas es crear nuevas variantes de proteínas con aplicaciones en la biología o la industria. Esto se logra modificando la secuencia de los aminoácidos de las proteínas existentes para cambiar o mejorar su función, no directamente en la proteína, sino en su gen como se explicó antes. Al proceso de modificación de la secuencia de un gen se le conoce como mutagénesis, y puede ser específica (en alguna posición que hayamos decidido, basados en información previa) o aleatoria (que ocurre al azar en distintas posiciones de la secuencia). Debido a que no conocemos la función de cada aminoácido en las proteínas, la mutagénesis con esta estrategia ha sido más exitosa debido a que provoca cambios aleatorios a lo largo de la cadena, resultando en una mayor probabilidad de éxito para crear proteínas con funciones de utilidad práctica.

Existen distintos métodos con los que el gen de una proteína puede mutagenizarse aleatoriamente, la mayoría basados en la introducción de cambios en el ADN al momento de ser copiado por una enzima (la llamada ADN polimerasa), que es propensa a equivocarse. No obstante, estos métodos presentan una tendencia en los cambios realizados, es decir, ciertos cambios ocurren más frecuentemente que otros. Una tendencia en la mutagénesis se refleja en favorecer la presencia de algunas de las proteínas obtenidas, provocando la pérdida de variantes potencialmente exitosas.

Recientemente, en nuestro laboratorio desarrollamos un método químico de mutagénesis aleatoria sin tendencia, basado en la síntesis de pequeñas cadenas de ADN llamadas oligonucleótidos. De manera convencional, estos compuestos son fabricados en equipos especializados que unen cada uno de los cuatro nucleótidos A, C, G y T (que en el equipo se encuentran separados y puros) en la secuencia deseada (por ejemplo: ATGCATCACCAT). Sin embargo, en el método de mutagénesis que nosotros creamos, cada uno de los nucleótidos puros es reemplazado con un nucleótido “contaminado” con los otros tres, dando como resultado cierta probabilidad de cambio en cada posición respecto a la secuencia original. Debido a que la reactividad química de los cuatro nucleótidos es similar, la probabilidad de que se incorporen a la secuencia depende directamente de la proporción de “contaminación”, es decir que la probabilidad de incorporación de cada uno de los cuatro nucleótidos es directamente proporcional a su porcentaje en la mezcla de reacción. Por ejemplo, si para incorporar una T (timina) a la secuencia se utiliza una mezcla de T (97%), A (1%), C (1%) y G (1%), se generará una probabilidad de mutagénesis del 3% (ya que del total 100 hay 3% de los “contaminates” A, C y G). Esto permite modular el grado de mutagénesis a criterio, simplemente cambiando la proporción de los nucleótidos en el tubo de reacción. Una vez generados los oligonucleótidos mutados, éstos son ensamblados enzimáticamente para dar lugar a una variedad de genes mutados, “salpicados” con mutaciones, y por ello el método se denomina “Spiked Genes”

Una vez que se implementa un técnica o método nuevo, hay que determinar qué tan efectivo resulta, por lo que para validar el nuestro escogimos el gen de una proteína modelo. Así, generamos cambios en la secuencia del gen de la proteína roja fluorescente llamada mKate, muy útil en Biología Molecular porque como su nombre lo indica es una proteína que fluoresce de color rojo cuando su secuencia es la natural. Las proteínas codificadas por los genes mutados en la síntesis química que nosotros llevamos a cabo, dieron como resultado variantes verdes, amarillas y anaranjadas (debido a los cambios estructurales y sus interacciones producidos en la proteína nueva), diferentes a la proteína roja original (Figura 2). Cuando analizamos las secuencias resultantes de la mutagénesis responsable de los diferentes colores, observamos homogeneidad en los cambios introducidos, así como una tasa de mutagénesis similar a la predicha, lo que demostró la ausencia de una tendencia favorecida en los cambios puntuales de nucleótidos.

Los resultados de nuestro trabajo son una aportación al campo de la ingeniería de proteínas que permitirá el mejoramiento de otras proteínas de interés, tanto en los laboratorios de investigación como a nivel industrial.

Este trabajo fue originalmente publicado en el siguiente artículo científico:

Cárcamo E., Roldán-Salgado A., Osuna J., Bello San-Martín I., Yañez J.A., Saab-Rincón G., Viadiu H., Gaytan P. (2017), Spiked Genes: A Method to Introduce Random Point Nucleotide Mutations Evenly throughout an Entire Gene Using a Complete Set of Spiked Oligonucleotides for the Assembly, ACS Omega, 2, 3183-3191.

Fuente: Revista Biotecnología en Movimiento

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