Dr. Gabriel Corkidi Blanco y Dr. Alberto Darszon Israel

El espermatozoide es una célula flagelada cuya misión es fecundar al gameto femenino. Esta célula tiene un reto de gran envergadura que consiste, después de ser eyaculado, en recorrer el tracto genital femenino hasta llegar al lugar donde reside el óvulo, en donde uno sólo, entre millones que se depositaron en el tracto, logrará el objetivo de fecundarlo. Durante su recorrido, el espermatozoide madura en un proceso conocido como “capacitación”, para poder llevar a cabo su compleja misión. Este proceso involucra cambios tanto de permeabilidad iónica como bioquímicos que lo transforman durante el trayecto. Sin esta capacitación, el espermatozoide es incapaz de llegar y fecundar al óvulo. Algunos de los espermatozoides capacitados cambian radicalmente su forma de nado al hiperactivarse. El batido de su cola o flagelo se vuelve asimétrico, más lento y aparentemente con movimientos caóticos e impulsivos. Por el contrario, el flagelo oscila de manera más simétrica y uniforme en los que no se hiperactivan; sin embargo, este último tipo de movimiento no favorece su desplazamiento en el medio viscoso del tracto genital femenino.

Se conoce mucho sobre el batido flagelar del espermatozoide en términos de sus características dinámicas y fisiológicas. Sin embargo, hasta hace poco tiempo, sólo se había podido estudiar el nado de esta célula observando su movimiento en 2 dimensiones (2D) a través del microscopio, es decir, en un sólo plano. Esto es como si viéramos nadar a una persona desde lo alto y lo que apreciaríamos sería la ‘proyección’ en el plano de todos sus movimientos. Desde esa perspectiva seríamos incapaces de saber si sus brazos y piernas se despegan de la superficie del agua en la alberca ni a qué altura se estarían posicionando.

¿Qué relevancia podría tener caracterizar el movimiento del espermatozoide en 3 dimensiones (3D)? De entrada, en condiciones reales, el espermatozoide se desplaza en el tracto genital femenino transitando entre nado libre en 3D y cerca de las paredes en cuasi 2D. Por este motivo, sería un error asumir que varias de las características que se han medido en sólo 2D son apegadas a la realidad en 3D. Por ejemplo, se ha observado que un espermatozoide humano nadando libre – mente en medio acuoso se desplaza alrededor de un treinta por ciento más rápido que cuando su flagelo bate restringido a la superficie de una laminilla de vidrio donde se puede observar en un microscopio óptico. Si su velocidad de nado cambia al estar libre, podemos sospechar fuerte – mente que también su flagelo se moverá de manera diferente. En el mismo ejemplo de nuestro nadador, podemos imaginar que le sería más fácil desplazarse en una alberca con cierta profundidad, que si nada en un ‘chapoteadero’ en donde el movimiento de sus brazos y piernas se vería obstaculizado por el fondo de la alberca.

¿Qué información podríamos extraer del movimiento en 3D de esta célula y su motor, y con qué objetivo? ¿Una técnica con capacidad de medir en 3D tendría más sensibilidad que la bidimensional? ¿Se pueden obtener datos adicionales que no son observables en 2D? La respuesta es contundentemente afirmativa. En nuestras investigaciones hemos logrado detectar características tanto mecánicas como fisiológicas que eran inaccesibles en 2D. Una pregunta importante que surge es, por ejemplo, si la baja proporción de espermatozoides que se hiperactivan se debe a un cambio sutil en la forma de su movimiento. Pensamos que la alta sensibilidad del análisis 3D podría responder esta pregunta brindando nueva información y conocimiento al importante campo de la fecundación.

¿Cuáles son las limitantes tecnológicas principales que han impedido el estudio 3D de estas células? Uno de los problemas centrales es que el microscopio óptico sólo puede enfocar un plano, por lo que cuando se usa esta tecnología, se confina a los espermatozoides para nadar en una su – perficie plana para poder así analizar ‘las proyecciones’ en el plano de sus movimientos 3D. Por otra parte, los microscopios confocales sí pueden hacer observaciones tridimensionales, analizan – do varios planos ópticos muy delgados cubriendo un cierto volumen, sin embargo, su principal limitante es la velocidad a la que se pueden adquirir estos planos. El flagelo del espermatozoide bate en promedio entre 4-15 veces por segundo, lo que limita el uso de tecnología confocal para poderlo estudiar en 3D. Recientemente se desarrolló una técnica que permite analizar una gran cantidad de espermatozoides de manera simultánea en 3D. Se trata de la holografía SIN LENTE (técnica que obtiene imágenes tridimensionales con el uso del rayo láser) que proyecta directamente la información tridimensional sobre un sensor de imágenes. Esta técnica tiene la posibilidad de estudiar las características espacio-temporales de miles de células en una sola captura; sin embargo, es incapaz de hacer mediciones funcionales de fluorescencia. Por ejemplo, el calcio intracelular es un regulador fundamental de la dinámica molecular del batido flagelar y la forma como nada el espermatozoide; éste se determina por métodos fluorescentes.

El objetivo de este artículo es describir la tecnología que desarrollamos recientemente en nuestro grupo de investigación y que permite hacer por primera vez, tanto el análisis dinámico como funcional en células individuales de espermatozoide.

¿Cómo funciona esta tecnología?

Usamos un microscopio óptico al cual le adaptamos un dispositivo piezo-eléctrico en el objetivo (la lente). Este dispositivo está basado en un cristal que al aplicarle un voltaje controlado puede expandirse y contraerse a su estado original. De esta manera, si aplicamos un voltaje en forma de onda oscilatoria, el cristal se expandirá y contraerá a la misma frecuencia del voltaje que aplicamos. Este dispositivo puede expandirse hasta 400 micras. Con este procedimiento logramos que el plano focal del objetivo se desplace a lo largo de un volumen cilíndrico al expandirse y contraerse el dispositivo piezo-eléctrico. Al oscilar el objetivo a una frecuencia relativamente grande, por ejemplo 100 Hz (ciclos por segundo), lograremos ‘barrer’ el volumen donde está contenido el espermatozoide 100 veces por segundo, lo que garantizará que podremos capturar cada fase del movimiento tridimensional del espermatozoide en forma de ‘rebanadas ópticas’. En el caso del ‘nadador’, si éste da una brazada levantando los brazos, la altura a la que los levante será detectada por las rebanadas donde sus brazos aparecerán enfocados.

El otro elemento indispensable para poder capturar esta información es el sensor de imágenes. Nuestro sensor debe tener la particularidad de poder capturar imágenes a gran velocidad ya que este parámetro es el que definirá el número de rebanadas ópticas con las que podremos contar en cada barrido del volumen conteniendo al espermatozoide. Puesto que el flagelo del espermatozoide bate entre 4-15 veces por segundo, requerimos, según la precisión con la que queramos hacer el análisis cuantitativo, de una cámara capaz de adquirir un mínimo de 3000 imágenes por segundo. Nuestra cámara en campo claro (en la que la iluminación no se altera por el uso de polarizadores o filtros), puede capturar hasta 8000 a una resolución de 640 x 480 pixeles.

Con esta tecnología, que además es capaz de medir la fluorescencia de colorantes sensibles al calcio y a otros iones, hemos logrado establecer por primera vez que el calcio intracelular del espermatozoide de humano varía de manera sincronizada con su batido, información que no se había logrado detectar en el análisis en sólo 2D. La sensibilidad y precisión de esta técnica nos está permitiendo hacer nuevas preguntas que no se habían podido responder por falta de una estrategia sofisticada para abordarlas.

Proyecto apoyado por CONACyT 253952

El Dr. Gabriel Corkidi es el responsable del Laboratorio de Imágenes y Visión por Computadora y el Dr. Alberto Darszon pertenece al Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, ambos del IBt. En este proyecto participan los Drs. José de Jesús Fernando Montoya Nava y Paul Hernández Herrera quienes realizan una estancia posdoctoral en el IBt.

Fuente: Revista Biotecnología en Movimiento