En los últimos años, las tecnologías que permiten a los científicos estudiar el ADN de una persona con una resolución de una sola molécula han ampliado enormemente nuestro conocimiento del genoma humano, el microbioma y las bases genéticas de las enfermedades. Con una visión tan detallada del ADN, es posible ver variantes genéticas y detalles estructurales que eran simplemente indetectables con tecnologías de secuenciación anteriores.

Sin embargo, los métodos actuales de referencia para el análisis de una sola molécula normalmente requieren al menos 150.000 células humanas , que contienen millones de moléculas de ADN individuales. Eso significa que los investigadores no pueden aplicar estas herramientas cuando sólo hay unos pocos miles de células disponibles, como en muchas biopsias de tumores, lo que limita el potencial científico y clínico de estas tecnologías.

Ahora, investigadores de los Institutos Gladstone han desarrollado dos nuevas herramientas para el análisis de una sola molécula que reducen la cantidad de ADN necesaria entre un 90 y un 95%. Su trabajo, publicado en la revista Nature Genetics , muestra cómo estas herramientas podrían permitir a los científicos abordar preguntas biológicas que antes no podían responder.

“Hemos estado trabajando para crear estos métodos durante mucho tiempo”, dice Vijay Ramani, Ph.D., investigador asistente en Gladstone y autor principal del estudio. “Estamos muy emocionados de ver qué descubrimientos serán posibles ahora”.

‘Etiquetar’ el ADN para una visión más clara

La primera de las nuevas herramientas, conocida como “secuenciación en tiempo real de una sola molécula mediante tagmentación”, o SMRT-Tag, amplía los protocolos establecidos para mapear simultáneamente la secuencia de bases en un fragmento largo de ADN y las ubicaciones de estructuras químicas llamadas grupos metilo . que se encuentran a lo largo del ADN. Los grupos metilo desempeñan un papel clave en la expresión genética , lo que los hace esenciales para comprender las enfermedades, por lo que es importante ver cómo están configurados en el ADN.

“Cuando tenemos muy poco ADN con el que trabajar, no podemos simplemente hacer más copias del ADN y aplicar nuestros protocolos habituales”, dice Ramani. “Hacer copias eliminaría estos patrones de metilación e introduciría otros errores”.

En cambio, su equipo adaptó un enfoque llamado “tagmentación”, que reutiliza la proteína bacteriana Tn5 para cortar simultáneamente moléculas de ADN en fragmentos más manejables y etiquetarlos con los componentes químicos necesarios para análisis posteriores.

La etiquetación ya se utiliza para secuenciar fragmentos cortos de ADN cuando sólo se dispone de pequeñas cantidades de ADN, pero sólo se puede obtener información limitada de fragmentos cortos.

El desafío para el equipo de Ramani era conseguir que la bioquímica de la etiquetación fuera la adecuada para romper pequeñas cantidades de ADN en trozos largos de entre 3.000 y 5.000 pares de bases. Su método “etiqueta” los extremos de cada fragmento con estructuras en forma de horquilla, creando largos bucles de ADN que pueden leerse de forma fiable mediante la maquinaria secuenciadora.

“Fue un esfuerzo bastante heroico por parte del personal y los estudiantes de mi laboratorio”, dice Ramani. “Tuvimos que probar diferentes versiones de Tn5 y casi 100 condiciones diferentes con diferentes tampones, enzimas y temperaturas. Cuando se trabaja con cantidades tan pequeñas de ADN, cualquier problema que cause pérdida de ADN es un problema mucho mayor. “

Datos procesables a partir de muestras pequeñas

Una vez que optimizaron SMRT-Tag, el equipo demostró que funciona tan bien como los protocolos establecidos, pero utilizando cantidades mucho más bajas de ADN, aproximadamente la cantidad que se encuentra en tan solo 10.000 células.

“Utilizando maquinaria de secuenciación de una sola molécula estándar de oro, nadie ha secuenciado nunca una cantidad tan pequeña de ADN con la cobertura que hemos logrado ahora”, dice Ramani.

A continuación, su equipo combinó SMRT-Tag con un método que habían desarrollado previamente llamado SAMOSA, abreviatura de “ensayo de secuenciación de oligonucleosomas metilados de adenina de una sola molécula”.

SAMOSA revela patrones de metilación adicionales que reflejan la accesibilidad a la cromatina, o la facilidad con la que la maquinaria de expresión genética puede acceder a diferentes tramos de ADN.

Ahora, con la nueva herramienta SAMOSA-Tag, los investigadores pudieron evaluar la accesibilidad a la cromatina con mucho menos ADN del que se necesitaba anteriormente. Para demostrarlo, lo aplicaron a células de cáncer de próstata (algunas del tumor inicial de un paciente y otras de un tumor que se había extendido a una ubicación diferente del cuerpo) que habían sido trasplantadas y cultivadas en ratones. El método reveló diferencias en la accesibilidad a la cromatina que apuntan a posibles impulsores clave de la metástasis del cáncer.

“Este es sólo un ejemplo de cómo nuestras herramientas podrían aplicarse a muestras clínicamente relevantes en cáncer y otras enfermedades en las que el ADN escasea”, dice Siva Kasinathan, MD, Ph.D., quien codirigió el estudio con Ramani. “Creemos que hay algunos frutos al alcance de la mano que podrían desbloquear alguna biología nueva, que podría ser importante para ayudar a los pacientes en el futuro”.

Kasinathan, miembro clínico del Lucille Packard Children’s Hospital de la Universidad de Stanford, es científico visitante en Gladstone y colaborador de Ramani desde hace mucho tiempo.

El equipo de Ramani ahora está optimizando SMRT-Tag y SAMOSA-Tag para trabajar con cantidades aún más pequeñas de ADN. También continúan compartiendo y actualizando periódicamente sus protocolos en línea, invitando a otros investigadores a recibir comentarios y colaboración. “La comunidad y las personas involucradas son realmente importantes en la historia de este trabajo”, dice Ramani.

En particular, destaca su trabajo con Kasinathan, a quien conoció mientras estaban juntos en la escuela de posgrado en la Universidad de Washington. Juntos, conceptualizaron el estudio. “Ha sido muy significativo trabajar con uno de mis amigos más cercanos para publicar lo que creemos que será un trabajo de gran impacto para la salud humana”.

Fuente: pgys.org